【行業標準】WS/T 797-2022現場消毒評價標準
?前 言
本標準由國家衛生健康標準委員會消毒標準專業委員會負責技術審查和技術咨詢，由中國疾病預防控制中心負責協調性和格式審查，由國家衛生健康委疾病預防控制局負責業務管理、法規司負責統籌管理。
本標準起草單位：山東省疾病預防控制中心、中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所、江蘇省疾病預防控制
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本標準由國家衛生健康標準委員會消毒標準專業委員會負責技術審查和技術咨詢，由中國疾病預防控制中心負責協調性和格式審查，由國家衛生健康委疾病預防控制局負責業務管理、法規司負責統籌管理。
本標準起草單位：山東省疾病預防控制中心、中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所、江蘇省疾病預防控制中心。
本標準主要起草人：崔樹玉、楊彬、劉雷、張流波、孫文魁、沈瑾、劉峰、王金強、楊志、徐燕。
本標準規定了現場消毒評價原則和現場消毒效果評價方法。
本標準適用于傳染病疫源地處理、突發公共衛生事件處置和重大活動衛生保障中環境、物品等的消毒效果評價。
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下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本標準必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本標準；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。
GB/T 5750.2?生活飲用水標準檢驗方法 水樣的采集和保存
GB/T 5750.12?生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標
現場消毒?disinfection on site
發生傳染病流行、突發公共衛生事件或重大活動衛生保障時對現場環境和物品等進行的消毒。3.2
目標微生物target microorganism
指示微生物?indicator microorganism
具有確定的抗力并代表某類微生物、可供現場模擬評價使用的人工污染微生物。
4.1?現場消毒評價的內容包括現場消毒過程評價和現場消毒效果評價。進行現場消毒效果評價前，應先進行現場消毒過程評價。
4.2?現場消毒過程評價的內容包括消毒方案、消毒產品、消毒工作程序、個人防護。消毒方案制定應根據消毒范圍、消毒對象選擇合理的消毒方法和消毒產品。使用的消毒產品符合WS 628?等標準要求，在產品有效期內按照說明書規定的方法使用。消毒工作程序符合GB 19193?要求。根據病原微生物的危害程度和傳播途徑選擇個人防護裝備。
4.3?現場消毒效果評價包括現場評價和現場模擬評價。對重大活動衛生保障和目標微生物明確的傳染病疫源地、突發公共衛生事件進行現場清毒效果評平價時，首選現場評價；對目標微生物無法檢測、不明原因的傳染病疫源地及突發公共衛生事件、風險等級較高的污染如炭疽桿菌、新冠肺炎病毒等進行消毒效果評價時選擇現場模擬評價。
4.4?現場評價是以檢測消毒對象上自然菌的存在數量或（和）目標微生物是否存在作為判定依據，現場模擬評價是以檢測指示微生物是否存在或存在的數量作為判定依據。
4.5?物體表面現場模擬評價根據病原微生物對消毒因子的抗力選擇相應的指示微生物，選擇大腸桿菌（Escherichia coli）8099、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538?作為親脂病毒、細菌繁殖體的指示微生物；選擇白色念珠菌（Candida albicans）ATCC 10231?作為致病性真菌的指示微生物；選擇龜分枝桿菌膿腫亞種（Mycobacterium chelonae subsp.?Abscessus）CMCC 93326?或?ATCC 19977?作為親水病毒、人結核分枝桿菌的指示微生物；選擇枯草桿菌思色變種芽孢（Bacillus subtilis var.?niger）?ATCC 9372?作為細菌芽孢的指示微生物；當發生未知病原微生物及不明原因傳染病時，選擇枯草桿菌黑色變種芽孢（Bacillus subtilis var.?niger）ATCC 9372?作為指示微生物。物體表面現場模擬評價已選擇抗力強的指示微生物進行評價時不再選擇抗力弱的指示微生物，除非有特殊要求。
4.6?生活飲用水現場模擬評價選擇大腸桿菌（Escherichia coli）8099?作為指示微生物。
4.7?根據現場消毒評價對象選擇合適的微生物種類進行評價，見表1。
4.8?現場消毒效果評價應記錄地點或對象、采樣時間、數量、采樣者、樣本編號、名稱、檢驗指標及依據、檢驗結果及判定等信息。
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大腸桿菌8099、金黃色葡萄球菌ATCC6538、白色念珠菌ATCC 10231、龜分枝桿菌膿腫亞種CMCC 93326?或ATCC 19977、枯草桿菌黑色變種芽孢ATCC 9372
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注1：評價指標除滿足以上要求外，還應符合相應標準。
注2：傳染病疫源地、突發公共衛生事件不得檢出目標微生物。
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磷酸鹽緩沖液（PBS，0.03mol/L，pH7.2）、采樣液（在PBS中加入相應中和劑）、中和劑（經鑒定試驗合格者）、無菌棉簽、無菌規格板（5.0cm×5.0cm）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基等。5.1.1.2?布點要求
以桌面、地面、墻面、床頭柜、便器、門把手等高頻率接觸物體表面為重點采樣對象，在消毒因子難以達到的地方如抽屜、地毯、墻角等可增加采樣點，每類采樣對象采集樣本不少于2個。消毒前、后采樣點應成對設置，不得在同一區域內進行。采樣總數不少于30個。
5.1.1.3.1?消毒前采樣：用無菌規格板放在被檢物體表面，用浸有采樣液的棉簽1支，在規格板內橫豎往返均勻涂擦各5次，并隨之轉動棉簽，以無菌操作方式將棉簽采樣端剪入盛有10mL.無菌采樣液的試管內。不適宜用規格板的小型物體表面（如兒童玩具、門把手、熱水瓶把等）可按件采樣。
5.1.1.3.2?消毒后采樣：消毒至設定時間后，在消毒前采樣點附近類似部位或同類物體進行，其步驟和方法同消毒前采樣。
消毒前、后樣本于4h?內送實驗室進行檢測。將采樣管在混勻器上振蕩?20s?或用力振打80次，吸取1.0mL?待檢樣品接種于無菌平皿，每一樣本接種2個平皿，加入已溶化的?45℃～48℃的胰蛋白胨大豆瓊脂培養基15mL～18mL，邊傾注邊搖勻，待瓊脂凝固，置?36℃±1℃，培養?48h，記錄菌落數，計算殺滅率。
營養瓊脂培養基、含相應中和劑（經鑒定合格）的營養瓊脂培養基等。
5.1.2.2.1?消毒前采樣：將擬消毒房間的門窗關好，在無人條件下靜止?10min?后，室內面積≤30m2，在對角線內、中、外3點各放置一個無菌營養瓊脂平板，高度為0.8m～1.5m，內、外部位應距墻壁≥1m，打開平板蓋，暴露一定時間后蓋好。各平板應做好標記。如室內面積>30m2，每增加10m2增設1個點。采樣點應避開通風口、通風道等。
5.1.2.2.2?消毒后采樣：空氣消毒達到規定的時間后，在消毒前采樣的相同位置上，另放一組加相應中和劑的營養瓊脂平板。放置方法和暴露時間與消毒前采樣相同。同時取2個未經采樣的相同平板作為陰性對照。
消毒前空氣自然菌平均菌落數≤10CFU/（皿·10min）時，可不計算殺滅率，消毒后空氣自然菌平均菌落數≤4CFU/皿·10min），判為消毒合格。
消毒前、后按GB/T 5750.2、GB/T 5750.12采樣和檢驗，消毒后水樣檢驗時加相應的中和劑，按式（1）計算殺滅率。
按照《消毒技術規范》（2002年版）4.7.4.2“排泄物、嘔吐物的檢測方法”執行。
細菌繁殖體及枯草桿菌黑色變種芽孢ATCC 9372、龜分枝桿菌膿腫亞種CMCC 93326或ATCC 19977、白色念珠菌ATCC10231懸液制備分別按照《消毒技術規范》（2002年版）2.1.1.2.3、2.1.1.8.3、2.1.1.9.3?和WS/T 683執行。染菌法陽性對照組回收菌量應為5×105CFU/cm2～5×106CFU/cm2。
按照《消毒技術規范》（2002年版）2.1.1.2.4和WS/T 683所示方法制備。載體應根據消毒對象及消毒因子的特性選擇，可選用金屬片、玻璃片、棉布片等載體進行染菌，每個菌片的回收菌數應為1×106CFU/片～5×106CFU/片。
根據現場情況，選擇桌面、地面、墻壁及墻角、書櫥、床底、屋頂、抽屜等消毒因子難以到達的地方布點。
磷酸鹽緩沖液（PBS，0.03mol/L，pH7.2）、稀釋液（含0.1%吐溫80的PBS溶液）、中和劑、培養基（營養球瓊脂培養基、胰蛋白陳大豆瓊脂培養基、分枝桿菌干燥培養基、沙堡葡萄糖瓊脂，麥芽浸膏瓊脂等）、無菌棉簽、無菌規格板（5.0cm×5.0cm）、無菌平皿等。
5.2.5.1.1.1?現場消毒組：現場消毒效果評價人員按照生物安全防護級別采取相應的防護措施后進入擬消毒現場，按照布點要求選擇現場物體表面較平的部位，于規格板中央空格內用無菌棉簽沾以菌懸液均勻涂抹現場實物表面，并予以暗號標記，待自然干燥后由消毒人員進行現場消毒。每類物體布點不少于2個，總布點數量不少于30個。
5.2.5.1.1.2?陽性對照組：另選擇與消毒現場相似的環境，與消毒前采樣環境對應類別物體另行選擇區塊人工染菌自然干燥，不進行現場消毒，每類物體至少選擇2個陽性對照。
消毒完成后，用無菌棉簽于含10mL中和劑試管中沾濕，分別對現場消毒組和陽性對照組布點區塊進行涂抹采樣，每區塊橫豎往返各5次，以無菌操作方式將棉簽采樣端剪入原中和劑試管內，振蕩混勻，于4h內送實驗室進行檢測。采樣管在混勻器上振蕩20s或用力振打80次進一步混勻，適當稀釋后，吸取1.0mL接種平皿，每個樣本接種2個平皿，加入已溶化的45℃～48℃的相應培養基15mL～18mL，邊傾注邊搖勻，待瓊脂凝固，置36℃土1℃培養，大腸桿菌和白色念珠菌培養48h、魚分枝桿菌膿腫亞種培養1周、細菌芽孢培養72h，計數存活菌落數（CFU/皿）。
5.2.5.2.1.1?現場消毒組:現場消毒效果評價人員按照生物安全防護級別采取相應的防護措施后進入消毒現場，將預先制備的1片染菌載體置于無菌平皿內，按照布點要求布點于消毒現場，布點數不少于30個，由現場消毒人員進行消毒。
5.2.5.2.1.2?陽性對照組:另取4個無菌平皿，分別放入1片預先制備的染菌載體，放置于與消毒現場溫濕度相似的環境中，不做任何消毒處理，作為陽性對照組。
消毒工作結束后，用無菌方式將現場消毒組和陽性對照組的載體分別取出移入含?5.0mL中和劑試管中，于4h?內送實驗室進行檢測。在混勻器上振蕩20s?或用力振打80次，使載體上的菌被洗脫進入中和劑中，再放置?10min?以上，按照5.2.5.1.2的方法計數存活菌落數。
大腸桿菌（8099）、微孔濾膜濾器和濾膜（濾膜孔徑為0.45μm）、抽濾水泵或氣泵、恒溫水浴箱、品紅亞硫酸鈉培養基、中和劑（經鑒定合格）。
5.3.2.1?取36℃±1℃培養18h～24h的新鮮大腸桿菌斜面，用稀釋液洗下菌苔，適當稀釋配制成試驗用大腸桿菌懸液。
5.3.2.2?分別取擬消毒水樣3份，每份500mL，加入大腸桿菌懸液，混勻，制備染菌水樣。每份取適量水樣進行過濾，濾完后，再抽氣?5s，關閉濾器閥門，用無菌鑷子夾取濾膜邊緣，移放在品紅亞硫酸鈉培養基平板上。濾膜的細菌截留面朝上，濾膜與培養基完全緊貼。將平板倒置，放于36℃±1℃，培養48h，計數濾膜上生長的大腸桿菌數，應在5×102CFU/100mL～2×103CFU/100mL。
5.3.2.3?在3份染菌水樣中分別加入消毒劑，迅速混勻，使其達到擬消毒濃度。消毒至規定時間，每份水樣分別移取2份，每份?100mL，分別注入裝有相應中和劑的無菌三角燒瓶中，以終止消毒作用。然后進行抽濾，方法同消毒前，計數濾膜上生長的大腸桿菌數。
5.4.1?現場評價時，若消毒前采樣菌落計數較少導致無法計算殺滅率，應采用現場模擬評價。
5.4.2?發生高致病性傳染病時現場模擬評價宜選擇載體法，采樣時不宜將平皿帶出消毒現場，可用無菌鑷子將載體直接取出移入試管中進行計數存活菌數，試管架、試管框等現場實驗器材底部可鋪墊一次性使用的無菌用品，帶出現場后立即對所有器材進行消毒。
5.4.3?現場消毒效果評價采樣及現場消毒人員應嚴格按照生物安全防護級別做好個人防護。試驗操作應根據有關規定做好防護措施，并在相應生物安全級別的實驗室內進行，避免污染環境或感染操作者。
